Fotony to elementarne cząsteczki przenoszące energię fal elektromagnetycznych, innymi słowy – to z nich składa się światło. Wiele procesów wokół nas wywoływana jest przez interakcje fotonów z różnymi rodzajami materii, jak na przykład fotosynteza, fotografia czy fotoluminescencja którą wykazują świetliki i grzyby. Fotony są również niezbędne do funkcjonowania mikroskopów optycznych. Jednak mikroskopy optyczne są ograniczone w zakresie obrazowania żywych komórek in vivo (czyli wewnątrz organizmu) ze względu na małą głębokość wnikania wiązki światła oraz dużą absorpcję światła widzialnego przez tkanki. Te i wiele innych problemów można rozwiązać za pomocą mikroskopii wielofotonowej, opartej na procesie absorpcji wielofotonowej, co pozwala na skanowanie miejsc niedostępnych dla typowych mikroskopów optycznych.
Photon is an elementary particle transporting the energy of electromagnetic waves, in other words – it is a building block of light. Plethora of processes around us are induced by interaction of photons with various types of matter: photosynthesis, photography or photoluminescence incorporated by glowing bugs and mushrooms. Photons are also a basis of optical microscopes. However, optical microscopes are limited concerning in vivo imaging of living cells because of low focus penetration depth and huge tissue absorption of visible light. All those issues and many more could be overcame using multiphoton microscopy based on multiphoton absorption process to scan places inaccessible for typical optical microscopes.
Jak to działa?/How does it work?
Fotoluminescencja zachodzi gdy cząsteczka w skutek oddziaływania z fotonem uzyskuje energię, a następnie traci ją, emitując foton o energii (kolorze) odpowiadającej właściwościom tej cząsteczki. Na przykład, gdy niebieski foton uderza w cząsteczkę barwnika takiego jak fluoresceina cząsteczka emituje foton zielony. [1] Co więcej, możemy przekazać energie fluoresceinie dwoma lub trzema czerwonymi fotonami, z których każdy ma połowę energii niebieskiego fotonu i w rezultacie otrzymać ten sam zielony emitowany foton. Proces ten nazywany jest fluorescencją wzbudzoną wielofotonowo, która jest podstawą mikroskopii wielofotonowej, a zdarzenie, w którym dwa fotony są absorbowane w celu wzbudzenia cząsteczki do stanu wzbudzonego, nazywa się absorpcją dwufotonową. [2]
Photoluminescence occurs when a molecule interacts with photon, gains it energy and then lose it by emitting a photon corresponding to the intrinsic properties of that molecule. For example when a blue photon hits a molecule of a dye like fluorescein, the molecule could emit green light. [1] Moreover, we can hit the fluorescein with two or three red photons, each having half of the energy of blue photon, and obtain the same green emitted photon as a result. This process is called multiphoton excited fluorescence, which is a basis of multiphoton microscopy, and the event in which two photons are absorbed to excite the molecule to its excited state is called two-photon absorption. [2]
Układ mikroskopu wielofotonowego rozpoczyna się od źródła światła które jest w stanie wytworzyć moc w plamce lasera na próbce rzędu 1010–1012Wcm2 (rys. 1). [3] Najczęściej stosowane są wysoce powtarzalne (100 MHz) lasery femtosekundowe. Następnie, wiązka lasera jest odbijana przez lustro dichroiczne (więcej o nim w rozdziale o mikroskopie konfokalnym) do soczewki obiektywu i skupiana na próbce. Fluorescencja indukowana dwoma fotonami jest generowana w niewielkiej objętości próbki, ponieważ prawdopodobieństwo zajścia dwufotonowej absorpcji jest bardzo niskie i efektywnie zachodzi jedynie w samym środku zogniskowanej przez obiektyw wiązki. Obrazy są konstruowane poprzez skanowanie objętości fluorescencyjnej w trzech wymiarach przy użyciu stolika piezoelektrycznego (dokładny stolik który porusza się dzięki zwiększaniu lub zmniejszaniu rozmiarów specjalnego materiału pod wpływem pola elektrycznego) poruszającego obiektyw lub próbkę we wszystkich trzech wymiarach. Następnie fluorescencja jest zbierana przez ten sam obiektyw (tryb epifluorescencyjny), przechodzi przez zwierciadło dichroiczne i jest skupiana przez soczewkę na fotodetektorze.
The design of two-photon microscope system starts with is its light source being able to produce power in the laser spot on the sample of order of 1010–1012Wcm2(Fig.1). [3] Most popular are highly repetitive (100MHz) femto-second lasers. Next, the laser beam is reflected by a dichroic mirror (more about it in the section about confocal microscope) to the objective lens and focused on the sample. Two-photon induced fluorescence is generated at the tiny volume, because the probability of two-photon absorption is very low and only effective in the exact center of focused beam. Images are constructed by scanning the fluorescent volume in three dimensions using a piezoelectric stage (precise stage moving due to the expansion of special material in electric field) moving the objective or a sample in all three dimensions. Then, fluorescence is collected by the same objective (epi-fluorescent mode), passes through a dichroic mirror and is focused by lens on a photodetector.
Historia/ History
Opowieść o wynalezieniu mikroskopu wielofotonowego rozpoczyna się od noblistki Marii Goeppert-Mayer (urodzonej w Katowicach!), Która w swojej rozprawie doktorskiej w 1931 r. opracowała teorię absorpcji dwufotonowej. Jednak jako że absorpcja dwufotonowa wymaga wielu fotonów zogniskowanych w jednym punkcie, efekt zweryfikowano eksperymentalnie dopiero po wynalezieniu laserów przez Kaisera i Garreta w 1963 roku. Pierwszy mikroskop dwufotonowy został zbudowany przez Denka w 1990 roku, który również opisał jedną z największych zalet tego mikroskopu – znacznie zmniejszone fotowybielanie (niszczenie fluoroforu z czasem z powodu oświetlenia) w porównaniu z mikroskopem konfokalnym. [4]
Story about the invention of multiphoton microscope starts with Noble prize winner, Maria Goeppert-Mayer (born in Katowice!) who developed a theory of two-photon absorption in her doctoral thesis in 1931. However, two-photon absorption needs a high number of photons focused in one point to appear, so the effect was verified experimentally after the invention of lasers by Kaiser and Garret in 1963. First two-photon microscope was built by Denk in 1990, who also reported one of the biggest advantages o this microscope – highly reduced photobleaching (destruction of fluorophore over time due to the illumination) comparing to confocal microscope. [4]
Plusy i minusy/Pros and cons
Po pierwsze, długości fal wzbudzenia dwufotonowego są zwykle około dwa razy większe niż długości fal wzbudzenia jednofotonowego (używanego w standardowych mikroskopach), co pozwala na lepsze oddzielenie widma wzbudzenia i emisji oraz sprawia że światło wzbudzające i rozpraszanie Ramana mogą zostać łatwo odrzucone z obrazu. Po drugie, mikroskopia dwufotonowa jest odpowiednia do obrazowania próbek biologicznych, ponieważ promieniowanie w bliskiej podczerwieni, stosowane w wzbudzaniu dwufotonowym, ma o rzędy wielkości mniejszą absorpcję w próbkach biologicznych niż promieniowanie UV lub światło widzialne. Ta właściwość pozwala również na skanowanie głębszych tkanek i obserwację procesów zachodzących w ich wnętrzu w czasie rzeczywistym. Co więcej, mikroskopia konfokalna wykorzystuje aperturę otworkową (więcej na jej temat w mikroskopi konfokalnej) do odrzucania nieostrego światła spoza płaszczyzny skupienia wiązki. Mikroskopia dwufotonowa nie wymaga apertury otworkowej i minimalizuje utratę sygnału. Zastosowanie światła podczerwonego i lasera impulsowego zmniejsza również uszkodzenia próbki podczas pomiaru, co czyni ją najlepszym wyborem do obrazowania żywych organizmów lub komórek. [3]
Z drugiej, mimo że mikroskopia dwufotonowa posiada szereg zalet w porównaniu do mikroskopu konfokalnego, ma również niższą rozdzielczość przestrzenną. Rozdzielczość mikroskopu skaluje się odwrotnie do długości fali używanego światła. Wzbudzenie dwufotonowe wymaga zastosowania wzbudzenia o długości fali dwukrotnie większej niż w przypadku mikroskopii konfokalnej czy fluorescencyjnej, co daje w przybliżeniu połowę rozdzielczości. [3]
Firstly, two-photon excitation wavelengths are typically about twice the one-photon excitation wavelengths which allows for wide separation between excitation and emission spectrum and ensures that the excitation light and the Raman scattering can be rejected. Secondly, two-photon microscopy is particularly suited for imaging in biological specimens because the near-infrared radiation used in two-photon excitation has orders of magnitude less absorption in biological specimens than UV or blue-green light. This property also allows to scan deeper into tissues and see the processes undergoing inside in a real-time. Moreover, confocal microscopy uses the emission pinhole aperture to reject out-of-focus light. Two-photon microscopy requires no pinhole aperture and minimizes signal loss. Using the infra-red light and pulsed laser also reduces the photodamage done during the measurement to the sample, making it the best choice for imaging living organisms or cells. [3]
On the other hand, two-photon microscopy has a number of unique advantages when compared with the confocal approach but it has also lower spatial resolution. The resolution of microscope scales inversely with the wavelength of light used. For a given fluorophore, two-photon excitation requires the use of excitation at twice the one-photon wavelength, resulting in approximately half the resolution. [3]
Zastosowania/Applications
Mikroskopia dwufotonowa może być skutecznie stosowana w dziedzinach takich jak fizjologia, neurobiologia, embriologia i inżynieria tkankowa, w których wymagane jest obrazowanie wysoce rozpraszającej tkanki. Jego najczęstsze zastosowania [5] to:
- Nieinwazyjne obrazowanie tkanek mózgu in vivo
- Obrazowanie populacji neuronów
- Obrazowanie siatkówki
- Mikrochirurgia
- Anatomia
- Transfekcja DNA
- Reaktywacja fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)
- Fotoaktywacja fluoroforów
- Fotoliza wzbudzona dwufotonowo
- Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET)
- Obrazowanie wysoce nieprzezroczystych tkanek, takich jak ludzka skóra
- Nieinwazyjna biopsja optyczna
Two-photon microscopy is expected to have an impact in areas such as physiology, neurobiology, embryology and tissue engineering, for which imaging of highly scattering tissue is required. Its most common applications [5] are:
- Non-invasive in vivo imaging of brain tissues
- Imaging neuronal population
- Imaging in the retina
- Microsurgery
- Sectioning anatomy
- DNA transfection
- Fluorescence recovery after the photobleaching (FRAP)
- Photo-activation of caged fluorophores
- Two-photon excited photolysis
- Fluorescence resonance energy transfer (FRET)
- Imaging highly opaque tissues such as human skin
- Non-invasive optical biopsy
Bibliografia/References:
[1] Rubart M. Two-photon microscopy of cells and tissue. Circ Res. 2004 Dec 10;95(12):1154-66.
[2] Larson, A. Multiphoton microscopy. Nature Photon 5, 1 (2011).
[3] Peter TC So, “Two-photon Fluorescence Light Microscopy”, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA
[4] Colin J. R. Sheppard, “Multiphoton microscopy: a personal historical review, with some future predictions,” J. Biomed. Opt. 25(1) 014511 (22 January 2020)
[5] Svoboda K., Yasuda R., “Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience”, Neuron, Volume 50, Issue 6, 2006, Pages 823-839