Mikroskopia jasnego pola jest najprostszą i najbardziej rozpowszechnioną techniką mikroskopii optycznej. Jest to właściwie zarazem najstarsza i podstawowa technika stosowana w każdym mikroskopie optycznym. Sam pomysł sięga średniowiecza, ale pierwsza praca naukowa w tej dziedzinie została opublikowana przez Roberta Hooke’a w 1667 roku i nosiła tytuł „Micrographia”. Typowy obraz uzyskany za pomocą mikroskopu jasnego pola jest ciemny na białym tle. Światło przechodzące przez próbkę jest bardziej pochłaniane (co znaczy, światło wychodzące z drugiej strony próbki jest osłabione), w miejscach, w których próbka jest bardziej gęsta i te miejsca wydają się ciemniejsze, ze względu na mniejszą ilość przepuszczonego światła. W tym samym czasie, światło przechodzące wokół obiektów na próbce tworzy jasne, białe tło, co daje nam obraz kontrastowy. W przypadku mikroskopii w ciemnym polu uzyskujemy przeciwny obraz. Tło jest czarne, a obiekty białe. Chociaż na pierwszy rzut oka obraz ciemnego pola może wydawać się negatywem jasnego pola, w rzeczywistości w każdym z nich widoczne są różne efekty. Technika ciemnego pola została wynaleziona w 1830 roku, aby przezwyciężyć ograniczenia wynikające z białego tła. Podobnie jak w przypadku gwiazd, w ciągu dnia ich nie widzimy, jednak możemy je obserwować w nocy, a im ciemniejsze niebo, tym więcej gwiazd możemy dostrzec dzięki większemu kontrastowi. [1,2,3,4,5]
Bright-field microscopy is the simplest and the most common optical microscopy technique. It is actually the oldest and basic technique used in every optical microscope. The idea goes back to the Middle Ages, but the first scientific paper in this field was published by Robert Hooke in 1667 and was called “Micrographia”. Typical image obtained from Bright-field Microscope is dark with white background. Light passing through the sample is more absorbed (that means the transmitted light is attenuated), in more dense places of the sample, and these places appear darker, as less amount of light is transmitted. At the same time, light passing around the objects on the sample is creating white background and that gives us a contrast image. In case of dark-field microscopy we are obtaining the opposite image. The background is black, while the objects are white. While the dark-field image might at first glance seem to be a negative of the bright-field, in fact different effects are visible in each. Dark-field technique was invented in 1830 to overcome the limitations coming from the white background. Just like in the case of stars, you cannot see them during the day, but you can see them well in the night, and the darker is the sky the more stars you can see thanks to the greater contrast. [1,2,3,4,5]
W obu technikach nie potrzebujemy drogiego i wyrafinowanego sprzętu. Pomiędzy źródłem światła a szkiełkiem z preparatem umieszczona jest soczewka kondensora. W przypadku techniki jasnego pola cała wiązka światła jest zbierana przez tę soczewkę. Aby stworzyć obraz w ciemnym polu, pod soczewką umieszcza się dodatkowo nieprzezroczysty dysk pełniący rolę osłony. Środkowa część wiązki światła jest zablokowana i tylko skośne promienie pochodzące pod dużym kątem są zbierane przez soczewkę kondensora i docierają do próbki. Podczas gdy obraz w technice jasnego pola jest tworzony ze światła, przeszło przez próbkę i nie zostało zaabsorbowane, obraz w technice w ciemnego pola składa się ze światła, które jest rozpraszane przez próbkę i wokół niej. Dlatego pierwszą metodą możemy obserwować budowę morfologiczną i wewnętrzną preparatu, a drugą bardzo szczegółowo ukazać budowę zewnętrzną. [3,6,7,11]
In both techniques we don’t need any expensive and sophisticated equipment. Between the source of light and the glass slide with specimen, there is a condenser lens placed. In case of bright field technique, the whole beam of light is collected by this lens, but to create dark-field image, underneath this lens an opaque disc is placed additionally, that is playing a role of light-shield. The central part of the light beam is blocked and only the oblique rays originating at large angles are collected by the condenser lens and reach the sample. While the image in bright-field technique is created from the light that is transmitted through the sample, in dark-field the image is composed from the light that is scattered by passing through and around the sample. That’s why using the first method we are able to observe morphological and internal structure of the specimen, and the second show us the external structure in great detail. [3,6,7,11]
Zdolność rozdzielcza obiektywu jest taka sama w obu metodach, jednak mikroskopia w ciemnym polu skuteczniej poprawia kontrast i ułatwia oglądanie próbek na trudnym tle (o zbliżonej wartości współczynnika załamania światła dla tła i dla próbki), których nie można dobrze zobrazować pod mikroskopem w jasnym polu. To świetna technika ujawniania krawędzi i granic oraz gradientów współczynnika załamania światła. Dobrymi kandydatami do obserwacji w jasnym i ciemnym polu są żywe organizmy wodne, małe owady, drożdże, włosy, komórki w kulturach tkankowych i nie tylko. Za pomocą mikroskopii w jasnym polu możemy obserwować ich naturalne lub barwione kolory, natomiast w ciemnym polu barwa nie jest widoczna, jednak czasami możemy zobaczyć „fałszywe kolory”. Podczas przygotowywania próbek do mikroskopii w ciemnym polu należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ obiekty, które znajdują się powyżej i poniżej płaszczyzny ogniskowania, takie jak kurz lub odciski palców, również mogą rozpraszać światło. Grubość przygotowanej próbki odgrywa istotną rolę w obu metodach. [6,7,9,10]
The resolving power of the objective is the same in both methods, but dark-field microscopy is more effectively enhancing the contrast and making it easy to see samples on difficult backgrounds, that cannot be well imaged under bright-field microscope. It’s great technique to reveal edges and boundaries and refractive index gradients. Good candidates for both bright and dark-field observations are living aquatic organisms, small insects, yeasts, hairs, cells in tissue culture and more. Using bright-field microscopy we are able to observe their natural or stained colors, while in dark-field the color is not visible, however sometimes we can see “false colors”. While preparing the samples for dark-field microscopy, special care should be taken, since features that lie above and below the plane of focus, like dust or fingerprints also can scatter the light. The thickness of the sample plays a role in both methods. [6,7,9,10]
Obie zaprezentowane techniki mikroskopowe mogą być stosowane nie tylko w mikroskopach optycznych, ale również w mikroskopach elektronowych, np. w Transmisyjnym Mikroskopie Elektronowym, gdzie zamiast wiązki światła używamy wiązki elektronów. Zasada działania obrazowania w jasnym i ciemnym polu pozostaje taka sama. [3]
These microscopy techniques can be applied not only in optical microscopes but also in electron microscopes, for example Transmission Electron Microscope, where instead of light beam, we are using electron beam. The working principle of bright- and dark-field imaging stays the same. [3]
Granica rozdzielczości mikroskopu optycznego jasnego pola, która wynosi około 200nm, została już osiągnięta. Można go nazwać przodkiem innych, potężniejszych i wciąż rozwijających się optycznych technik mikroskopowych, np. mikroskopii olejowej czy nowoczesnych technik mikroskopowych, takich jak mikroskopia fluorescencyjna i wielofotonowa. Osobno rozwijana jest również mikroskopia ciemnego pola, szczególnie w technikach obrazowania pojedynczych nanocząstek. [4,5]
The resolution limit of bright-field optical microscope, which is around 200nm is already reached. We could call it the ancestor of other optical microscopic techniques that are more powerful, and are still evolving, e.g., oil immersion microscopy, or modern microscopy techniques like fluorescence microscopy and multi-photon microscopies. Separately, the dark field microscopy is also being developed, particularly in single nanoparticle imaging techniques. [4, 5]
Bilbiografia/References:
[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Bright-field_microscopy
[2] G. Wang and N. Fang, Detecting and Tracking Nonfluorescent Nanoparticle Probes in Live Cells, P. Michael (ed.), Methods in Enzymology, 2012, Volume 504, p. 87
[3] https://en.wikipedia.org/wiki/Dark-field_microscopy
[4] https://www.leica-microsystems.com/science-lab/a-brief-history-of-light-microscopy-from-the-medieval-reading-stone-to-super-resolution/
[5] P. F. Gao, G. Lei, and C. Z. Huang, Dark-Field Microscopy: Recent Advances in Accurate Analysis and Emerging Applications, Anal. Chem. 2021, 93, 4707−4726
[6] https://www.microscopyu.com/techniques/stereomicroscopy/darkfield-illumination
[7] https://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/dfield.html
[8] http://www.tutorsglobe.com/homework-help/microbiology/dark-field-microscope-72650.aspx
[9] https://www.microbehunter.com/what-are-the-differences-between-brightfield-darkfield-and-phase-contrast/
[10] https://www.olympus-lifescience.com/en/discovery/what-is-darkfield-microscopy/
[11] https://microbiologynote.com/12-difference-between-darkfield-and-bright-field-microscope/