Rozwój mikroskopi fluorescencyjnej stanowił duży krok w rozwoju nauk biologicznych i nauk o materiałach ponieważ pozwalał na zobaczenia rzeczy wcześniej niewiedzialnych i spowitych ciemnością. Jednak każdy wynalazek posiada swoje ograniczenia. Dla standardowego mikroskopu fluorescencyjnego ograniczenia te związane były z grubością badanych próbek. Fluorescencja emitowana z materiałów grubszych niż 2 mikrometry zachodzi z całej wzbudzanej objętości co prowadzi do utraty większości szczegółów widocznych na obrazach. Mikroskop konfokalny potrafi pokonać te ograniczenia wykorzystując techniki filtrowania przestrzennego, które pozwalając wyeliminować fluorescencję zbieraną z obszaru wokół ogniska obiektywu obecną w grubszych próbkach. [2] Jednak przed wyjaśnieniem w jaki sposób mikroskop konfokalny działa, opowiedzmy trochę o historii tego odkrycia.
Fluorescence microscope was a huge step forward in biological and material sciences because it allowed us to see what was previously invisible and covered in darkness. However, every invention has its limitation. For conventional fluorescence microscope, the limit lies in the thickness of the sample. Fluorescence emitting from materials thicker than 2 micrometers occurs through the whole excited specimen volume leading to loss of the most fine details. Confocal microscope is able to overcome this drawback using spatial filtering techniques to eliminate out-of-focus signal from thicker specimens. [2] But before explaining how it works and listing its numerous advantages, let’s say something about the history of its invention.
W 1940 r. szwajcarski okulista z Berna, Hans Goldman, wynalazł pierwszy optyczny system konfokalny zwany lampą szczelinową, który w zmodyfikowanej wersji nadal jest używany do diagnozowania chorób oczu, takich jak zaćma. W 1943 roku Zyun Koana opublikował artykuł z rysunkiem przedstawiającym bieg konfokalnej wiązki transmisyjnej, a w 1951 roku jego kolega Hiroto Naora opisał konfigurację mikroskopu konfokalnego w prestiżowym czasopiśmie naukowym Science. [3] Jednak to Marvin Minsky, adiunkt na Uniwersytecie Harvarda, opatentował pierwszy mikroskop konfokalny. Minsky był matematykiem zainteresowanym sieciami neuronowymi i sztuczną inteligencją, który swego odkrycia dokonał chcąc zobaczyć nienaruszone komórki nerwowe w tkance mózgowej. Następny krok naprzód nastąpił w 1973 roku, kiedy David Egger i Davitodovits wymienili lampy o dużej intensywności, służącej do tej pory za źródło światła w mikroskopie konfokalnym, na lasery i opracowali pierwszy konfokalny mikroskop laserowy z mechanicznym skanowaniem . [4] Ten nowy typ mikroskopu szybko się rozwijał dzięki nowym metodom analizy danych, które zostały opracowane pod koniec lat 70-tych i 80-tych wraz z szybko rosnącym wzrostem mocy komputerów. W 1980 roku grupa z Oksfordu skupiona wokół Colina Shepparda i Tony’ego Wilsona opisała mikroskop konfokalny z epi-laserowym oświetleniem ( czyli gdy ten sam obiektyw służy do wzbudzania próbki jak i zbierania emitowanej przez nią fluorescencji ) oraz skanowanie etapowe, które umożliwiło skanowanie optyczne wzdłuż osi Z i umożliwiło trójwymiarowe obrazowanie próbek. [5]
In 1940, a swiss ophthalmologist from Bern, Hans Goldman, invented the first optical confocal system called slit lamp, which upgraded from is used today to diagnose eye disorders such as cataracts. In 1943, Zyun Koana published a paper with figure showing a confocal transmission beam path and in 1951, his colleague Hiroto Naora described a setup of confocal microscope in the prestigious scientific journal Science. [3] However, it was Marvin Minsky, a postdoctoral fellow at Harvard University, who patented the first confocal microscope. Minsky was a mathematician interested in neural networks and artificial intelligence who wanted to image the unstained neurons from a brain tissue. The next leap forward has taken place in 1973, when David Egger and Davitodovits exchanged high intensity lamp sources to lasers and developed the first mechanically scanned confocal laser microscope. [4] This new type of optical system thrived for new data analysis methods, which were developed in late 70’s and 80’s along the rapidly growing increase in computer power. In 1980, the Oxford-group around Colin Sheppard and Tony Wilson described a confocal microscope with epi-laser-illumination (when objective lens acts as both the source of light that excites the fluorophore and the element of the microscope that collects the emitted fluorescent light) and stage scanning which allowed optical scanning along the z-axis and made 3D images of specimens possible. [5]
Jak działa mikroskop konfokalny?/How does the confocal microscope work?
Aby to wytłumaczyć posłużymy się jednym z rodzajów mikroskopu konfokalnego czyli epi-fluorescencyjnego laserowego mikroskopu skaningowego. W takim układzie źródło światła stanowi laser. Wiązka lasera przechodzi przez aperturę otworkową (ang. pinhole), czyli mały idealny otwór wycięty w środku materiału nie wykazującego fluorescencji który służy jako filtr przestrzenny, a następnie filtr wzbudzenia, który wycina całe światło nie będące wiązką wzbudzającą lasera. Potem wiązka odbija się od lustra dichroicznego, czyli lustra które odbija jedne długości fali a inne przepuszcza (np. czerwona wiązka lasera się odbiję, natomiast zielona emisja z próbki przejdzie dalej) i jest skupione przez obiektyw mikroskopu wewnątrz próbki. Fluorescencja próbki jest zbierana tym samym obiektywem, przechodzi przez lustro dichroiczne, filtr emisji (działający analogicznie do filtru wzbudzenia, jednak teraz wycinającym całe światło poza emisją) i po przejściu przez kolejną aperturę otworkową – pada na fotodektor. Dzięki temu że próbka znajduje się na ruchomym stoliku, można skanować całą objętość próbki we wszystkich 3 wymiarach.
We will explain that using the epi-fluorescent laser scanning microscopy as a model (Picture 1). [2] Our light source which will excite fluorescence from a sample is a laser. Laser beam passes through a pinhole, which is non-fluorescent material with a circular hole in the middle fulfilling a role of a spatial filter, and excitation filter, which cuts off all the light except the laser beam. It reflects from the dichroic mirror, which is a mirror reflecting one wavelengths and transmitting others (for example laser green light is reflected, but specimen red fluorescence can pass through it) and then is focused on a sample using the microscope objective. Sample fluorescence is collected by the same objective, passes through a dichroic mirror, fluorescence filter (cutting of everything except the sample fluorescence) and after flowing through the next pinhole – hits a light detector. Scanning spot on the sample could be changed by moving the stage with specimen in X, Y and Z axis.
Jakie zalety oferuje mikroskop konfokalny?/What advantages does confocal microscope offer?
Największą zaletą jest możliwość skanowania grubszych próbek niż mikroskop fluorescencyjny (sięgających 50 mikrometrów lub więcej) jak na przykład tkanki lub różne minerały. Dzięki zastosowaniu filtrów przestrzennych (apertury otworkowej) rozdzielczość jest znacznie poprawiona, a fluorescencja tła (czyli z poza ogniska obiektywu) jest znacznie zmniejszona. Ponadto, przesuwanie stolika z próbką w osi Z umożliwia tworzenie obrazów 3D w postprocessingu. Korzystanie z wielu długości fal skanowania umożliwia wykrycie poszczególnych elementów żywych tkanek i komórek, umożliwiając łatwą obserwację zachodzących wewnątrz nich procesów biologicznych. Z drugiej strony, jak już wspomniano, każdy wynalazek ma swoje ograniczenia, a mikroskop konfokalny nie jest tutaj wyjątkiem. Lasery wzbudzające są drogie, a ich długości fal ograniczone, w przeciwieństwie do szerokiego zakresu długości fal wytwarzanych przez lampy dostępne w typowych mikroskopach fluorescencyjnych. Intensywne napromienianie laserem jest szkodliwe dla żywych tkanek i może doprowadzić do ich zniszczenia. Ponadto, cały system z kilkoma długościami fal, filtrami i systemem analizy danych jest drogi i nie każde laboratorium naukowe może sobie na to pozwolić. [5]
First and foremost benefit is the ability to do a sectioning scan of thicker samples (reaching 50 micrometers or more) like tissue specimens or various minerals. Due to the use of spatial filters (pinholes) resolution is greatly improved and the fluorescence from background highly reduced . Moving the sample stage in z axis enables creating 3D images in postprocessing . Using multiple scanning wavelengths make it possible to detect building blocks of living tissues and cells, allowing to observe the cellular biological processes with ease. On the other side, as previously stated, every invention has its limitation, and confocal microscope is not an exception. Excitation lasers are expensive and their wavelengths limited, in opposition to wide range of wavelengths produced by lamps available in typical fluorescent microscopes. The intense laser irradiation is harmful to living tissues, making some confocal microscope applications irreversibly invasive. Lastly, the whole system, with few wavelengths, filters and data analysis system is expensive and not every scientific laboratory can afford it. [5]
Jakie są zastosowania?/What are the applications?
Mikroskopy konfokalne są szeroko wykorzystywane w biologii i medycynie [6], przykładowe zastosowania to:
- Badania zmian patologicznych w tkankach nerowowych
- Badania morfologii komórek i tkanek
- Badania rezonansowego transferu energii między układami
- Badania komórek macierzystych
- Badania na temat fotowybielania
- Obrazowanie Czasów Życia Fluorescencji
- Mikroskopia wielofotonowa
- Mikroskopia Całkowitego Wewnętrznego Odbicia
- Badania nad hybrydyzacją DNA
- Wizualizacja i sprawdzanie aktywności membran i sond jonowych
- Badania właściwości bioluminescencyjnych białek
- Znakowanie epitopów
Confocal microscopes are broadly used in biology and medicine [6] with applications such as:
- Studying pathological changes in neuronal tissues
- Morphological studies of cells and tissues
- Investigating resonance energy transfer
- Stem cell research
- Photobleaching studies
- Fluorescence lifetime imaging
- Multiphoton microscopy
- Total internal reflection microscopy
- Studying DNA hybridization
- Visualizing and checking the activity of membranes and ion probes
- Researching the properties of bioluminescent proteins
- Epitope tagging
Bibliografia/References:
[1] https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/about/news/nikon-releases-confocal-microscope-with-worlds-largest-field-of-view [Accessed: 30.04.2021]
[2] https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/confocal/confocalintro/ [Accessed: 30.04.2021]
[3] Colin JR Sheppard (3 November 2009). “Confocal Microscopy. The Development of a Modern Microscopy”.
[4] Davidovits, P.; Egger, M. D. (1969). “Scanning laser microscope”. Nature. 223 (5208): 831.
[5] Shinya Inoué (2006). “Chapter 1: Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy”. In James Pawley (ed.). Handbook of Biological Confocal Microscopy (3. ed.). Springer Science and Business Media LLC.
[6] http://www.olympusconfocal.com/applications/ [Accessed: 30.04.2021]