Mikroskop fluorescencyjny to każdy mikroskop, który wykorzystuje fluorescencję lub fosforescencję do generowania obrazu. Fluorescencja to emisja światła, która zachodzi po absorpcji światła, które ma zwykle krótszą długość fali. Odfiltrowując światło wzbudzające bez blokowania emitowanej fluorescencji, można zobaczyć tylko obiekty, które są fluorescencyjne znacząco zwiększając kontrast, a nawet zobaczyć pojedyncze cząsteczki [1]
Fluorescence microscope refers to any microscope that uses fluorescence or phosphorescence to generate an image. Fluorescence is the emission of light that occurs after the absorption of light which is typically of shorter wavelength. By filtering out the exciting light without blocking the emitted fluorescence, it is possible to see only the objects that are fluorescent, even single molecules when background is non-fluorescent. [1]
Cząsteczki wykazujące fluorescencję nazywane są fluoroforami. Gdy związki fluorescencyjne w stanie równowagi (tzw. „stan podstawowy”) pochłaniają światło o określonej energii (fotony), mogą przesunąć elektron na inną orbitę, która jest dalej od jądra. To przejście do „stanu wzbudzonego” następuje w ciągu femtosekund. Następnie elektron traci część swojej energii poprzez konwersję wewnętrzną i relaksację wibracyjną, przechodząc do najniższego stanu wzbudzonego. W zależności od struktury elektronowej, cząsteczka może powrócić ze stanu wzbudzonego do stanu podstawowego poprzez szybką fluorescencję lub fosforescencję o znacznie dłuższym czasie życia (ubrania lub naklejki świecące po naświetleniu światłem wykazują fosforescencję, ponieważ może to trwać nawet minuty, w porównaniu do trwającej nanosekundy fluorescencji) [1]
Molecules exhibiting fluorescence are called fluorophores. When
fluorescent compounds in equilibrum state ‘ground state‘ absorb light energy (photons) they could move an electron into a different orbital that is farther away from the nucleus. This transition to an ‘excited state’ occurs within femtoseconds. Then electron lose some of its energy via internal conversion and vibrational relaxation moving to the lowest excited state. Depending on the electronic structure, molecule can return from excited state to ground state via rapid fluorescence or phosphorescence, with much longer lifetimes (cloths or stickers glowing after the irradiation of light are exhibiting phosphorescence, because it can last even minutes, comparing to nanoseconds of fluorescence) [1]
Podstawowym elementem mikroskopu fluorescencyjnego jest zwierciadło dichroiczne, które działa jak specyficzny rozdzielacz długości fali, przepuszczając fluorescencję próbki, jednocześnie odbijając światło wzbudzające. [2] Większość źródeł światła stosowanych w takich mikroskopach to mocne białe lampy, więc potrzebny jest również filtr wzbudzający, który przepuszcza tylko określone długości fal (np. tylko światło niebieskie). Następnie zwierciadło dichroiczne odbija wiązkę wzbudzającą na próbkę (fluorofor). Potem, emisja (fluorescencja) jest zbierana z próbki za pomocą obiektywu. Następnie przechodzi ponownie przez lustro dichroiczne i filtr emisyjny, który odcina wszystkie inne długości fal niż emisja, do detektora, jak pokazano na rysunku 2.
Fundamental component of fluorescence microscope is dichroic mirror, which acts as a specific wavelength splitter, transmitting fluorescent light while reflecting excitation light back. [2] Most of light sources used in such microscopes are strong white lamps, so there is also need for an excitation filter, which will let pass only specific wavelengths (for example only blue light).Then, the excitation wavelength of light is reflected by the dichroic mirror onto a sample (fluorophore).Subsequent emission wavelength (fluorescence) is collected back from the sample usingthe objective. Next, it goes through the dichroic mirror again and emission filter, which cuts all other wavelengths than emission, to the detector, as shown in Figure2.
Mimo że fluorescencja pozwala na obserwacje próbek ze znacznie większą rozdzielczością, nie może być używana przez długi czas ze względu na fotowybielanie, czyli zniszczenie fluoroforu z powodu wielu cykli absorpcji i emisji światła. Ponadto cząsteczki niefluorescencyjne wymagają znaczników fluorescencyjnych, które mogą zmienić ich strukturę, a tym samym – zafałszować obraz.
Although, fluorescence allows to observe samples with much higher resolution, it cannot be used for a long time due to the photobleaching – destuction of fluorophore because of multiple cycles of absorption and emission of light. Moreover, non-fluorescent molecules needs fluorescent labels which can alter their structure and thus – falsify the image.
Zastosowania mikroskopu fluorescencyjnego: [1], [2], [4]
- analizować tekstury ciekłych kryształów zabarwionych cząsteczkami fluorescencyjnymi
- analiza cząsteczek wykazujących autofluorescencję
- tworzenie złożonego obrazu 3D próbki
- wizualizacja agregacji cząsteczek fluorescencyjnych
- wykrywanie określonych cząsteczek i wizualizacja ich dystrybucji
Applications of fluorescence microscope: [1], [2], [4]
- analyze textures of liquid crystals stained with fluorescent molecules
- analysis of molecules exhibiting autofluorescence
- creating a composite 3D image of the sample
- visualizing aggregation of fluorescent molecules
- targeting specific molecules and visualizing their distribution
Mikroskop fluorescencyjny stał się bardzo użytecznym narzędziem w biologii, ponieważ umożliwia obrazowanie zabarwionych składników tkanek, bakterii i innych patogenów, umożliwiając naukowcom obserwowanie skomplikowanych reakcji biochemicznych w nich zachodzących w czasie rzeczywistym.
Fluorescence microscope has become a useful tool in biology since fluorochromes were initiated in biological investigations to stain tissue components, bacteria, and other pathogens allowing researchers to observe complicated biochemical reactions in a real time.
Bibliografia/References:
- Lichtman, J. W., & Conchello, J.-A. (2005). Fluorescence microscopy. Nature Methods, 2(12), 910–919.
- https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy
- https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_microscope
- Abe K, Usami A, Ishida K, et al. Dielectric and fluorescence study on phase transitions in liquid crystal 5CB and 8CB[J]. J. Korean Phys. Soc, 2005, 46: 220.